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英属哥伦比亚大学使用八电子RED96e系统快速确定相互作用动力学

肽盘肽的生物素化版本

英属哥伦比亚大学

James Saville, Lucy Troman, Franck Duong Van Hoa

8通道八重奏系统:八重奏RED96e

所面临的挑战

膜蛋白(MP)仅占蛋白质的30%,但却占目前治疗靶点的60%以上。膜蛋白作为药物靶点的这种过度表达是因为它们在细胞外很容易被获取,并且在营养物质的摄取、细胞通讯以及细胞与环境的相互作用中起着至关重要的作用。尽管膜蛋白具有明显的基础和医学意义,但其在结构和相互作用数据库中的代表性严重不足,这主要是由于膜蛋白在水溶液中固有的不溶性,这是几乎所有生化分析的先决条件。这种溶解性问题是MP表征和开发作为治疗靶点的主要障碍。

解决方案

最近,英属哥伦比亚大学Duong实验室的成员开发了一种名为peptidisc的膜模拟物,它可以复制原生膜环境,同时保持膜蛋白在溶液中可溶。当两亲性肽的多个副本结合在目标膜蛋白的疏水性表面上时形成肽盘。在去除去垢后,脂质和膜蛋白会稳定地重构成肽盘,形成水溶性颗粒。肽盘的配方是由目标膜蛋白本身的大小和拓扑引导的,因此发生在自发的方式,需要很少的优化。

为了分析肽盘稳定膜蛋白的蛋白-配体相互作用,使用已建立的基于链亲和素的结合分析,在八聚体RED96e上可用,实验室引入了肽盘的生物素化版本。生物素官能团允许通过盘将肽盘颗粒附着在链亲和素包覆的尖端上。这些配体结合的针尖在含有结合物(分析物)的溶液中孵育,然后进入缓冲液中,测定分析物和配体的解离。在一天结束时,这个自动化的测量被保留在八隅体上运行,结果数据在第二天早上在10分钟内被分析。

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乐动体育买球福泰比奥的8通道八重奏系统在32分钟内完成96个样品的定量,在1.5小时内完成64个样品的动力学筛选。可以使用单个通道或最多8个通道进行分析,从而根据需要实现采样吞吐量的灵活性。八隅体RED96e可配置最小样品体积损失的可选微板蒸发盖。

结果

利用生物素化肽和八聚体RED96e系统,Duong实验室确定了细菌膜受体(FhuA)和抗菌肽Colicin m的结合动力学。设计的工作流程包括八聚体RED96e允许它们从生长的细胞出发,在24小时内测量相互作用。

由八隅体产生的互动动力学的实时读出使英属哥伦比亚大学的Duong实验室立即看到他们的实验是否建立正确,以及他们是否正在检测他们的互动。

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